Análise de apresentação de micoplasma

Verifique a qualidade das linhagens celulares que está utilizando!

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Qual a importância da avaliação da presença de micoplasmas em cultura de células?

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A introdução de antibióticos nos meios de cultivo de células minimizou o problema das contaminações bacterianas e fúngicas. Com isso, os micoplasmas passaram a ser os contaminantes detectados com maior frequência em células animais cultivadas. Como este tipo de contaminante não altera necessariamente a morfologia ou a cinética de multiplicação celular e o fato dos micoplasmas não serem visíveis ao microscópio óptico, somente testes específicos possibilitam sua detecção.

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É importante que as culturas celulares estejam livres de micoplasmas porque os resultados de vários tipos de experimentos podem ser alterados na presença destes contaminantes. As culturas contaminadas podem apresentar uma série de consequências em longo prazo como: taxa de crescimento alterada, alterações morfológicas, aberrações cromossômicas, alterações no metabolismo de aminoácidos e ácidos nucleicos, dentre outras.

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Métodos de identificação de micoplasmas utilizados no BCRJ

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O BCRJ utiliza ao menos dois métodos para avaliação da presença de micoplasmas nos cultivos celulares. Os mais utilizados são ensaios de PCR e Bioluminescência.

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PCR (Reação em cadeia da polimerase)

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O PCR tornou-se um método muito popular para a identificação de micoplasma nas culturas celulares pela alta sensibilidade e agilidade nos resultados, o que permite aos usuários tomar as devidas providências diante de uma contaminação. Este teste utiliza o sobrenadante das culturas celulares que passa por uma fase de extração do DNA e posterior amplificação de regiões comuns a diversos tipos de micoplasmas. A amplificação destes fragmentos determina a presença de micoplasmas nas amostras. Os resultados são visualizados em gel de agarose por meio de eletroforese.

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Bioluminescência

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É um teste bioquímico seletivo que explora a atividade de certas enzimas do micoplasma. A presença dessas enzimas fornece um procedimento rápido de triagem, permitindo uma detecção sensível da contaminação por micoplasma em uma amostra. A técnica baseia-se na lise dos micoplasmas viáveis, cujas enzimas presentes reagem com o substrato do kit que catalisa a conversão de ADP em ATP. Ao medir o nível de ATP em uma amostra, tanto antes quanto após a adição do substrato, uma relação pode ser obtida, que é indicativa da presença ou ausência de micoplasma. Se essas enzimas não estão presentes, a segunda leitura não mostra nenhum aumento em relação à primeira, enquanto a reação das enzimas dos micoplasma com seus substratos específicos no meio de reação leva a ATP em níveis elevados. A intensidade da luz emitida é linearmente relacionada à concentração de ATP e é medido com um luminômetro.

A importância da avaliação da presença de micoplasma em cultura de células, parceria BCRJ – LONZA.

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Fluorescência

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Esta técnica envolve o uso de um fluorocromo (Hoechst 33258) ou o DAPI, que se liga especificamente ao DNA. Com o auxílio de um microscópio epifluorescente, as culturas que apresentam micoplasmas aparecem como grânulos ao redor do núcleo.

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Microscopia Eletrônica de Varredura (MEV)

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Esta técnica permite a visualização dos micoplasmas nas amostras após os tratamentos adequados com a emissão de fotografias para o cliente.

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MEV de uma linhagem de fibroblasto contaminada com micoplasma.

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