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“O Banco Células do Rio de Janeiro (BCRJ) é o resultado do trabalho conjunto de cientistas, técnicos e estudantes da Universidade Federal do Rio de Janeiro e da Associação Técnico-Científica Paul Ehrlich.

Criado em 1980, por iniciativa do Professor Radovan Borojevic, o BCRJ tornou-se centro de referência e excelência em cultura de células no Brasil e no nosso continente. É a única coleção de células humanas e animais que atua como prestadora de serviços no Brasil e é a maior da América do Sul. “

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Reflexões e Perspectivas: Destaques do 1º Congresso Brasileiro de Métodos Alternativos ao Uso de Animais

Artigo escrito por: Daniela Costa/ Revisado por: Nívea Ferreira

Reflexões e Perspectivas: Destaques do 1º Congresso Brasileiro de Métodos Alternativos ao Uso de Animais
Queridos leitores,
Com entusiasmo, compartilhamos alguns momentos marcantes do 1º Congresso Brasileiro de Métodos Alternativos, realizado entre 6 e 9 de novembro, no Rio de Janeiro, no qual tivemos a distinta honra de ser patrocinadores. Este evento singular não só proporcionou um espaço para discussões inovadoras, mas também nos mergulhou no universo dos Métodos Alternativos ao Uso de Animais e muito mais.
No primeiro dia, 06/11, fomos agraciados com um convite especial para participar do Workshop da Humane Society International (HSI). O evento teve como foco a abordagem do tema “Promoção de planos de implementação para substituição de testes em animais para vacinas humanas”. Ele se destacou por oferecer insights e debates fundamentais sobre os Métodos Alternativos, incluindo uma discussão aprofundada sobre as Ferramentas para Planos de Implementação desses métodos, com ênfase especial no MAT (Teste de Ativação de Monócitos). Dificuldades foram enfrentadas de frente, e estratégias foram debatidas para superar os desafios na implementação desse método.

Participantes do Workshop da Humane Society International (HSI)

Destaques do Congresso: Explorando Fronteiras na Ciência Alternativa
Durante o Congresso, exploramos temas cruciais relacionados à transformação do cenário regulatório no contexto dos 3R’s (redução, refinamento e substituição) no uso de animais em pesquisa. Uma apresentação de destaque abordou as “Aplicações de Métodos Alternativos em Cosméticos”, fornecendo uma visão do panorama das inovações nessa área e da evolução regulatória na América Latina, um tema de suma importância principalmente após Resolução nº 58, de 24 de fevereiro de 2023, que dispõe sobre a proibição do uso de animais em pesquisa científica de produtos de higiene pessoal, cosméticos e perfumes. Outro ponto de ênfase foi “A progressão da Toxicologia Computacional na avaliação de riscos químicos”, delineando uma mudança de paradigma na compreensão da segurança dos produtos. A discussão sobre a “Avaliação de segurança de ingredientes através da integração de novas metodologias de abordagem (NAMs) na avaliação de risco de última geração (NGRA)” também trouxe à tona uma nova perspectiva na abordagem da toxicologia.

Inteligência Artificial/Inteligência Organóide: Uma Fronteira Promissora
Um destaque notável do congresso foi a palestra intrigante sobre “Inteligência Artificial/Inteligência Organóide”, apresentada pelo renomado Dr. Thomas Hartung. Seria este o ponto de virada em direção à nova fronteira da biocomputação e inteligência artificial in vitro? Durante a apresentação, foram compartilhados os avanços recentes em organoides cerebrais derivados de células-tronco humanas, que buscam replicar aspectos moleculares e celulares relacionados à aprendizagem, memória e até mesmo possíveis facetas de cognição in vitro. Para englobar esses progressos, o termo ‘inteligência organoide’ (OI) foi cunhado. Neste momento, encontra-se em andamento um programa colaborativo envolvendo a equipe do Dr. Thomas Hartung e colaboradores de diversas áreas, com o objetivo de tornar a OI uma realidade. A meta é estabelecer a inteligência artificial (IA) como uma forma legítima de computação biológica, utilizando organoides cerebrais de maneira ética.

Trajetória do Banco de Células e as Boas Práticas em Cultura de Células no 1º Congresso Brasileiro de Métodos Alternativos
Encerrando com grande destaque, queremos ressaltar a participação significativa da nossa empresa no evento. A Dra. Paola Capelletti, representando o BCRJ, foi convidada a apresentar a Trajetória do Banco de Células e a abordar as Boas Práticas em Cultura de Células aplicadas aos novos métodos alternativos in vitro. Este tema é de extrema importância para assegurar a qualidade, confiabilidade e integridade dos experimentos envolvendo culturas de células. Em um contexto mais amplo, essas práticas desempenham um papel crucial na área da toxicologia in vitro, onde as células são o sistema teste na avaliação do impacto de substâncias químicas, medicamentos, cosméticos ou agentes ambientais, eliminando a necessidade de testes em animais.
No cenário regulatório, a adesão rigorosa às Boas Práticas em Cultura de Células torna-se indispensável para garantir a aceitação dos dados gerados em estudos in vitro. Essa conformidade não apenas fortalece a integridade dos resultados, mas também simplifica significativamente o processo de aprovação regulatória para produtos farmacêuticos, químicos, cosméticos e outros compostos. A participação ativa e valiosa do BCRJ neste evento reflete nosso compromisso contínuo com a excelência na pesquisa e inovação em métodos alternativos, reafirmando nossa posição na vanguarda da ciência e da ética.
Nesse contexto, temos o prazer de compartilhar que, durante o evento, premiamos três participantes com uma vaga para cada curso oferecido pelo BCRJ na primeira turma de 2024. Parabenizamos calorosamente os agraciados: Alcides de Sousa Neto, para o Curso de Toxicologia in vitro; Maria Alice Fusco de Souza, para o Curso de Boas Práticas em Cultura de Células; e Fabio Takeo Sato, para o Curso de Cultivo de Células em 3D. Essa iniciativa reforça nosso compromisso em incentivar a formação e o avanço profissional na área, alinhado ao nosso constante empenho pela excelência em pesquisa e inovação em métodos alternativos. Parabéns a todos os ganhadores.
Agradecemos a todos que tornaram possível este Congresso inesquecível e estamos ansiosos para o que o futuro nos reserva na vanguarda da ciência alternativa!

11/16/2023

Mutagenicidade em Foco: O Teste de Ames ou Teste de Mutação Reversa Bacteriana

Artigo escrito por: Daniela Costa/ Revisado por: Paola Cappelletti

Olá, prezados leitores!
Na segunda edição da nossa newsletter, abordaremos o Teste de Ames, um procedimento essencial na avaliação da segurança de produtos químicos e compostos.
O Teste de Ames, nomeado em homenagem ao seu criador, o Dr. Bruce Ames, é uma técnica de triagem amplamente utilizada para avaliar a mutagenicidade de substâncias químicas. Este teste é baseado no uso de cepas bacterianas específicas, como Salmonella typhimurium e Escherichia coli, que foram geneticamente modificadas para não produzir um aminoácido essencial, como histidina (no caso de Salmonella) ou triptofano (no caso de E. coli). Essa modificação genética torna essas cepas bacterianas particularmente sensíveis a mutações.

Para ilustrar, tomemos o exemplo do sistema de teste que envolve Salmonella typhimurium incapaz de produzir histidina. A premissa fundamental desse teste reside na exposição dessas cepas mutantes a produtos químicos específicos (itens de teste que podem ser mutagênicos). Tendo a histidina como um aminoácido essencial para o crescimento celular, quando essas cepas são cultivadas em um meio que contém um item de teste mutagênico, o mesmo pode induzir uma mutação secundária no gene que codifica a histidina, substituindo a mutação original e promovendo a recuperação da capacidade dessa bactéria de sintetizar o aminoácido. Esse processo é conhecido como mutação reversa, e os produtos químicos que desencadeiam essa reversão são considerados mutagênicos.

Em termos práticos, nas culturas de S. typhimurium em que a reversão bacteriana não ocorre, não observamos a formação de muitas colônias. No entanto, nas cepas em que a reversão bacteriana acontece as colônias se desenvolvem em quantidade maior, isso indica que a substância testada causou uma segunda mutação, sendo, portanto, considerada mutagênica.

Legenda: Princípio do Teste de Ames

Realização do teste e suas diretrizes
Para garantir a validade dos resultados do Teste de Ames, é fundamental que as bactérias estejam na fase logarítmica do ciclo de crescimento, onde o número máximo de bactérias viáveis pode ser encontrado. Portanto, é crucial cultivar as bactérias até a fase exponencial tardia ou estacionária inicial, sendo desaconselhado o uso de culturas em fase estacionária tardia.
A seleção apropriada das cepas bacterianas é um passo crítico para o teste de Ames. Para obter resultados precisos e confiáveis, é necessário escolher cepas que sejam sensíveis a diferentes tipos de mutações. Além disso, seguir protocolos rigorosos é essencial para garantir a reprodutibilidade dos resultados. Um dos guias mais recomendados para a realização deste teste é o Guideline da OCDE TG nº 471, que estabelece diretrizes para o teste e é amplamente aceito internacionalmente. Esse documento está disponível gratuitamente no site da OCDE.
Normalmente, são usadas cinco cepas testadoras, dentre elas, quatro de Salmonella typhimurium (TA1535; TA1537 ou TA97a ou TA97; TA98; e TA100) e uma cepa E. coli WP2 uvrA, ou E. coli WP2 uvrA (pKM101), ou S. typhimurium TA102 em cada ensaio. O teste pode ser realizado por dois métodos convencionais: o Método de Incorporação de Placa Padrão e o Método de Pré-incubação. Em ambos os métodos, o item de teste é avaliado na presença e ausência de ativação metabólica (S9) para garantir a precisão dos resultados.

A incubação de todas as placas deve ser a 37°C durante 48-72 horas. Ao fim desse período, o número de colônias revertentes por placa é contabilizado. Um resultado positivo é caracterizado por um aumento dependente da concentração na frequência de reversão que excede os limites específicos da cepa. Para os resultados negativos, a interpretação é de que, nas condições do ensaio, o item de teste em estudo não é mutagênico nas espécies testadas.

Neste vídeo, https://vimeo.com/468729195, é possível conferir uma breve explicação sobre a realização do teste.

Momento apropriado para realizar o teste
Apesar de muitas empresas frequentemente não examinarem seus compostos quanto à mutagenicidade nas fases iniciais de desenvolvimento, essa não é uma prática recomendável, pois pode resultar em desperdício de tempo e recursos. Incorporar o teste de Ames nas fases iniciais do desenvolvimento de um produtos é crucial, especialmente quando é essencial avaliar a segurança de compostos. Isso permite a identificação precoce de potenciais problemas, economizando tempo e recursos a longo prazo.
O teste de Ames pode ser realizado em diversas situações, incluindo triagem de compostos, atendimento a requisitos REACH para o comércio na Europa, avaliação de impurezas, como nitrosaminas, e procedimentos de teste de Ames em conformidade com diretrizes específicas.
Em casos de recursos limitados, versões de triagem do teste de Ames podem ser utilizadas, como testes com ativação metabólica, doses máximas reduzidas, menos placas replicadas e redução do número de estirpes bacterianas examinadas. No entanto, é importante destacar que essas versões de triagem podem ter dificuldade em detectar mutagênicos fracos.

O impacto de um teste de Ames positivo
Um resultado positivo no teste de Ames indica que a substância testada tem o potencial de causar mutações genéticas, o que é uma preocupação significativa, uma vez que mutações podem levar ao desenvolvimento de câncer e outros problemas de saúde. Como resultado, um teste de Ames positivo pode desencadear investigações mais aprofundadas e, em alguns casos, pode resultar na interrupção do uso da substância ou do desenvolvimento de um produto. No entanto, é importante ressaltar que um teste positivo por si só não determina se uma substância é carcinogênica em seres humanos, mas serve como um indicador preocupante.

O Teste de Ames como alternativa ao uso de animais
Nos últimos anos, houve um movimento significativo para reduzir ou eliminar o uso de animais em pesquisas. Nesse contexto, o Teste de Ames se destaca como um método alternativo, uma vez que fornece uma maneira de avaliar a mutagenicidade in vitro, substituindo a necessidade de utilizar modelos animais para avaliação da mutagenicidade. Essa abordagem está alinhada com a crescente preocupação com o bem-estar animal e a busca por métodos mais éticos na pesquisa científica.
No Banco de Células do Rio de Janeiro estamos comprometidos em promover continuamente testes e ensaios que substituam, reduzam e refinem o uso de animais em experimentações. Como parte desse compromisso, temos o Teste de Ames disponível em nosso catálogo, proporcionando uma abordagem ética e eficaz na avaliação da segurança de produtos químicos. Continuaremos a inovar e avançar, buscando alternativas que priorizem o bem-estar animal e a excelência na pesquisa científica.

Referências:
Vijay U, Gupta S, Mathur P, Suravajhala P, Bhatnagar P. Microbial Mutagenicity Assay: Ames Test. Bio Protoc. 2018 Mar 20;8(6):e2763. https://doi.org/10.1016/B978-0-12-804667-8.00003-1. PMID: 34179285; PMCID: PMC8203972.

OECD (2020). Test No. 471: Bacterial Reverse Mutation Test. OECD Guidelines for the Testing of Chemicals, Section 4, OECD Publishing, Paris. Disponível em: https://doi.org/10.1787/9789264071247-en.

Jain, A.K., Singh, D., Dubey, K., Maurya, R., Mittal, S., Pandey, A.K. (2018). Models and Methods for In Vitro Toxicity. In: Dhawan, A., Kwon, S. (Eds.), In Vitro Toxicology. Academic Press. ISBN 9780128046678. Disponível em: https://doi.org/10.1016/B978-0-12-804667-8.00003-1

11/09/2023

ANVISA Autoriza Estudo Clínico com Células CAR-T: Mas afinal, o que são e como cultivá-las com sucesso em laboratório?

Artigo escrito por: Daniela Costa/ Revisado por: Antonio Monteiro

O futuro da medicina não está apenas em tratar doenças, mas em reprogramar células para curá-las.

Na vanguarda da medicina contemporânea, encontramos a incessante busca por terapias capazes de fornecer soluções eficazes para doenças complexas. A biotecnologia emerge como um dos campos mais promissores nessa exploração incessante, revelando avanços notáveis nos últimos anos no desenvolvimento de terapias celulares inovadoras. Entre essas inovações, destaca-se o uso das células CAR-T no tratamento do câncer, uma abordagem que tem o potencial de transformar a maneira como encaramos essa devastadora doença.

Recentemente, em 26 de setembro de 2023, a Agência Nacional de Vigilância Sanitária (ANVISA) concedeu autorização para a realização de um estudo clínico no Brasil envolvendo as células CAR-T. Essa autorização marca um significativo avanço na pesquisa médica do país e abre portas para uma nova era no tratamento do câncer.

O Hemocentro de Ribeirão Preto assume o estudo clínico de fase 1/2 que será realizado com 81 pacientes com leucemia linfoide aguda de células B e linfoma não Hodgkin de células. O programa de terapia com células CAR-T é uma colaboração entre o Hemocentro de Ribeirão Preto, a Universidade de São Paulo, a Fundação Butantan e o apoio de instituições de fomento, como a FAPESP e o CNPq.

Mas o que exatamente são as células CAR-T e por que essa autorização é tão importante?

Para compreendermos plenamente, é fundamental conhecermos alguns detalhes da produção e aplicação dessas células na terapia contra o câncer.

O processo de produção das células CAR-T é complexo e altamente especializado. Tudo começa com a coleta das células T do próprio paciente, geralmente por meio de um procedimento de leucaférese, que é a remoção terapêutica de leucócitos. Posteriormente, essas células T são transportadas para um laboratório especializado, onde passam por uma modificação genética. Nessa etapa, as células são geneticamente alteradas por meio de um vetor viral reprogramado, capaz de se associar às células humanas e combinar seus materiais genéticos com a nova informação genética associada a elas. Dessa maneira, as células T passam a expressar o receptor de antígeno quimérico (CAR), projetado especificamente para reconhecer células cancerosas, tornando as células T altamente direcionadas no combate ao câncer.

Após a modificação genética, as células CAR-T passam por um período de expansão em cultura, onde se multiplicam até atingir uma quantidade terapêutica suficiente. Esse estágio é crítico, pois garante a disponibilidade adequada de células CAR-T para combater o câncer. Por isso essas culturas exigem cuidados especiais, a fim de garantir a segurança do procedimento e manter a eficácia terapêutica quando as células forem reintroduzidas no paciente.

Em seguida, as células CAR-T são transferidas para o paciente após um período de condicionamento, que pode envolver quimioterapia a fim de preparar o corpo para a terapia celular. Quando administradas, essas células entram em ação, rastreando e destruindo células cancerosas que expressam o antígeno reconhecido pelo CAR.

Terapia com Células CAR-T.

O resultado desse processo é uma terapia altamente direcionada e eficaz, capaz de induzir a remissão do câncer em pacientes que não responderam a tratamentos convencionais. Importante destacar que as células CAR-T são personalizadas para cada paciente, uma vez que as próprias células são utilizadas, aumentando a eficácia e minimizando os riscos de rejeição.

Neste vídeo, https://vimeo.com/667271197, é possível conferir as células CAR-T em ação, combatendo as células tumorais em tempo real na cultura de células.

O Sucesso das Células CAR-T está além do design genético. Quais os principais fatores devem ser considerados para sua expansão em cultura?

O sucesso da terapia celular vai muito além do design genético das células CAR-T, pois está intrinsecamente ligado às condições do cultivo de células que influenciam sua funcionalidade.

Quando trabalhamos com culturas celulares, o primeiro passo é entender quais condições devem ser replicadas e como fazê-lo. A escolha do meio de cultura é o ponto inicial. No contexto da terapia celular, uma das opções é o uso de meios contendo 5% de soro humano. Contudo, os meios de cultura sem soro (SFM) têm ganhado preferência, pois reduzem a variabilidade na funcionalidade das células devido às flutuações esperadas na variação entre os lotes de soro. A decisão sobre qual utilizar depende de uma avaliação criteriosa sobre a qualidade das células, levando em consideração o potencial de expansão celular e a manutenção de um fenótipo de células T menos diferenciado, visando à persistência prolongada quando reinfundidas.

 A revisão de Watanabe et al. (2022) realiza uma análise abrangente de diversos artigos que ilustram o potencial e as comparações entre os meios de cultura com e sem soro humano para células CAR-T. Essa análise evidencia que ambos os tipos de meios podem proporcionar uma expansão eficaz, embora haja diferenças discerníveis entre eles.

 A escolha dos suplementos para o meio de cultura é igualmente determinante para a função das células. Em culturas citocinas podem ser utilizadas para estimular a proliferação celular. Para as células CAR-T, destacam-se as citocinas de cadeia gama, como IL-2, IL-7, IL-15 e IL-21 (Dwyer et al., 2019). Para decidir qual ou quais citocinas utilizar, deve-se considerar, novamente, o impacto na alteração do fenótipo e da função das células.

Além do meio de cultura, a duração do cultivo é um fator crítico. Em culturas primárias para terapia celular, é fundamental manter o período de cultivo o mais curto possível para garantir a funcionalidade ideal das células CAR-T. No entanto, essa duração pode variar dependendo das características clínicas do paciente. Podendo ser mais curto para paciente com doença agressiva, e mais longo para pacientes com contagens de células T mais baixas.

Outros fatores cruciais na terapia celular incluem a diferenciação das células e a senescência, algo esperado para culturas de células primárias e que, no caso das células CAR-T, pode ser acelerado também pelo uso de citocinas adicionadas como suplemento. Inibidores farmacológicos com potencial de suprimir a diferenciação e senescência das células T vêm sendo estudados como estratégia para melhorar a qualidade dessas células (Watanabe, 2022).

Por fim no que diz respeito a criopreservação e seu impacto na eficácia após o descongelamento. Dado que a criopreservação é uma etapa essencial na produção e distribuição da terapia, ao se implementar uma cultura de células CAR-T é vital analisar o método de criopreservação e otimizá-lo para alcançar os melhores resultados.

Estes são apenas alguns dos aspectos essenciais que devemos considerar ao abordar a terapia com células, como um todo, não apenas para as células CAR-T. A fase de expansão é um dos momentos cruciais para manter a qualidade e a segurança da terapia celular. Independentemente do tratamento, na área de culturas celulares, a pesquisa continua a todo vapor, buscando os melhores meios, suplementos e condições para proporcionar eficácia no tratamento do paciente.

Autorização da ANVISA: Um Novo Horizonte na Terapia com Células CAR-T

A autorização concedida pela ANVISA para estudo clínico com células CAR-T representa um avanço significativo no tratamento do câncer no Brasil, oferecendo uma nova luz de esperança para pacientes que enfrentam cânceres agressivos e resistentes aos tratamentos tradicionais. Além disso, evidencia o comprometimento do país em abraçar avanços médicos inovadores que têm o potencial de salvar vidas. Enquanto em outras partes do mundo, essa conquista permanece acessível a uma minoria privilegiada, no Brasil, a perspectiva é que em breve essa terapia seja incorporada ao Sistema Único de Saúde (SUS), tornando a cura uma possibilidade acessível a todos.

Para nós do Banco de Células do Rio de Janeiro, é grandioso ver terapias como essa emergindo do laboratório ao leito do paciente. Tornando a aplicação da cultura de células uma verdadeira arte de tecer fios de cura na imensa tapeçaria da vida.

Para mais informações sobre a autorização do estudo clínico, acesse a matéria completa no site da ANVISA e no site do Hemocentro Ribeirão Preto.

Para mais informações sobre as análises e serviços realizados pelo BCRJ, escreva para [email protected]

Referências:

ANVISA. ANVISA autoriza pesquisa clínica com células “CAR-T” no Brasil. Disponível em: https://www.gov.br/anvisa/pt-br/assuntos/noticias-anvisa/2023/anvisa-autoriza-pesquisa-clinica-com-celulas-201ccar-2013-t201d-no-brasil. Acesso em: 26 de setembro de 2023.

Dwyer CJ, Knochelmann HM, Smith AS, Wyatt MM, Rangel Rivera GO, Arhontoulis DC, Bartee E, Li Z, Rubinstein MP, Paulos CM. Fueling Cancer Immunotherapy With Common Gamma Chain Cytokines. Front Immunol. 2019 Feb 20;10:263. doi: 10.3389/fimmu.2019.00263.

Gumber D, Wang LD. Improving CAR-T immunotherapy: Overcoming the challenges of T cell exhaustion. EBioMedicine. 2022 Mar;77:103941. doi: 10.1016/j.ebiom.2022.103941.

Hemocentro da USP. Estudo Clínico para o tratamento de leucemia e linfoma. Disponível em: https://www.hemocentro.fmrp.usp.br/terapia/. Acesso em: 30 de setembro de 2023.

Watanabe N, Mo F, McKenna MK. Impact of Manufacturing Procedures on CAR T Cell Functionality. Front Immunol. 2022 Apr 13;13:876339. doi: 10.3389/fimmu.2022.876339.

10/02/2023
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